Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-10:2011

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8400-10:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 10: BỆNH LAO BÒ

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 10: Bovine tuberculosis disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh lao bò do vi khuẩn Mycobacterium bovis gây ra.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh lao bò (Bovine tuberculosis disease)

Bệnh mạn tính do trực khuẩn Mycobacterium bovis gây ra. Đặc trưng của bệnh là hình thành các hạt lao, thường thấy ở hạch phổi, hạch bạch huyết và các cơ quan nội tạng. Bệnh lao bò có thể lây nhiễm sang người.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

- Etanol (C2H6O).

- Fuchsin basic (C20H20ClN3).

- Xanh metylen (C16H18N3SCl).

- Axit clohydric (HCl).

- Kali hydroxit (KOH).

- Thiophen-2-carbonic axit hydrazide (TCH).

- Natri pyruvat (C3H3NaO3)

- Axit oxalic (C2H2O4)

- Amoni sắt (II) sulfat ((NH4)2Fe(SO4)2)

- Pyrazinamid (C5H5N3O)

- Các môi trường nuôi cấy phân lập: Lowenstein Jensen (LJ), Stonebrink, Coletsos base, Herrold egg yolk (HEY), Middlebrook 7H10 hay 7H11.

- Tuberculin PPD bò.

- Tuberculin PPD gà.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:  Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37oC

- Tủ sấy

- Nồi hấp

- Buồng cấy

- Kính hiển vi quang học

- Tủ lạnh

- Que cấy

- Đèn cồn

- Đĩa Petri để đổ môi trường

- Panh

- Kéo

- Lamen (coverlip)

- Phiến kính

- Pipet thủy tinh các cỡ

- Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml.

5. Cách tiến hành

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Đặc điểm dịch tễ

- Trâu, bò có thể bị nhiễm lao do tiếp xúc với trâu, bò bị bệnh hay từ vùng đã có dịch.  Bệnh lao có ở khắp nơi trên thế giới.

- Động vật non cảm thụ với vi khuẩn lao mạnh hơn động vật trưởng thành.

5.1.2 Triệu chứng lâm sàng

- Con vật bị bệnh gầy, yếu, lông dựng đứng, da khô, sốt nhẹ về chiều.

- Các triệu chứng của bệnh phụ thuộc vào vị trí phân bố của các hạt lao.

Nếu các hạt lao khu trú ở phổi: Con vật ho khan, ho từng cơn và ho nhiều hơn khi thời tiết thay đổi.

Nếu các hạt lao khu trú ở hạch: Các hạch bạch huyết sưng, cứng, sờ thấy lổn nhổn, nhất là các hạch ở trước vai, trước đùi, dưới hàm.

Nếu các hạt lao khu trú ở ruột: Con vật ỉa chảy, phân tanh khẳm hoặc ỉa chảy và táo bón luân phiên.

- Con vật gầy dần và có thể chết do suy nhược ở giai đoạn cuối của bệnh.

5.1.3. Bệnh tích

Bệnh tích đặc trưng là con vật có các hạt lao. Các hạt lao có thể ở trong các cơ quan nội tạng, màng treo ruột, ruột, màng phổi, màng bụng, vú,… nhưng hay gặp nhất là ở hạch phổi, hạch vùng đầu và các hạch bạch huyết ở xoang ngực.

Các hạt lao thường có màu vàng, hoặc màu trắng đục, dạng bã đậu hoặc dạng hạt xơ hay bị canxi hoá thành những khối tăng sinh thượng bì có kích thước như quả ổi. Trên cùng một cơ quan có thể thấy nhiều dạng hạt lao khác nhau.

Nếu hạt lao có nhiều trong phổi thì khi nắn các thuỳ phổi có cảm giác như phổi có trộn cát, cắt có tiếng kêu lạo xạo.

Ở giai đoạn đầu, bệnh lao có thể rất khó chẩn đoán qua mổ khám.

5.1.4 Phản ứng tiêm nội bì (tuberculin test)

Phản ứng này dùng để chẩn đoán bệnh lao cho động vật sống.

5.1.4.1 Vật liệu

- Tuberculin PPD bò.

- Tuberculin PPD gà.

5.1.4.2 Vị trí tiêm

Nếu chỉ tiêm 1 mũi tuberculin PPD cho bò thì chọn một vị trí da cổ hoặc ở giữa mặt trong của nếp gấp da đuôi.

Nếu tiêm cả 2 mũi tuberculin PPD cho bò và tuberculin PPD cho gà thì chọn 2 vị trí khác nhau ở cùng một bên cổ của con vật, khoảng cách giữa 2 vị trí là 12 cm đến 15 cm. Gia súc non có thể phải tiêm ở hai bên cổ.

Trước khi tiêm, cắt sạch lông ở vị trí tiêm, kiểm tra có tổn thương hay không.

Đánh dấu và đo độ dày của da trước khi tiêm tuberculin PPD bằng thước cặp.

Tiêm tuberculin PPD bò/gà vào trong da (tiêm nội bì) tại vị trí tiêm đã chọn.

Liều tiêm: Dùng không ít hơn 2000 UI tuberculin PPD bò/gà và lượng tiêm không quá 0,2 ml.

5.1.4.3 Đọc kết quả

Sau khi tiêm 72 h, đo độ dày nếp gấp của da và đánh giá kết quả như sau: Trường hợp tiêm một mũi, kết quả cho thấy:

- Độ sưng da không lớn hơn 2 mm và con vật không có các triệu chứng lâm sàng: âm tính;

- Độ sưng da lớn hơn 2 mm và nhỏ hơn 4 mm, con vật không có triệu chứng lâm sàng: nghi ngờ;  Độ sưng da lớn hơn 2 mm và nhỏ hơn 4 mm, con vật có triệu chứng lâm sàng: dương tính;  Độ sưng da bằng hoặc lớn hơn 4 mm: dương tính.

Với những động vật cho kết quả nghi ngờ thì sau 42 ngày làm lại phản ứng. Sau khi kiểm tra lần hai, nếu cho kết quả nghi ngờ hoặc dương tính, kiểm tra lại bằng phản ứng tiêm nội bì hai mũi tuberculin PPD bò và tuberculin PPD gà.

Đối với vị trí tiêm ở đuôi, phản ứng là dương tính khi độ sưng da tại vị trí tiêm trừ độ dày da bên không tiêm bằng hoặc lớn hơn 4 mm. Nếu bò có một nếp gấp da đuôi, phản ứng dương tính khi độ sưng da tại vị trí tiêm bằng hoặc lớn hơn 8 mm.

Trường hợp tiêm hai mũi, kết quả cho thấy:

- Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD bò (mm) bằng hoặc nhỏ hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm): âm tính;

- Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD bò (mm) lớn hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm), chênh lệch giữa hai độ sưng là từ 1 mm đến 4 mm: nghi ngờ;

- Độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD bò (mm) lớn hơn độ sưng da tại vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm), chênh lệch giữa hai độ sưng lớn hơn 4 mm: dương tính

5.1.4 Lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm

Lấy các mô nghi ngờ hoặc có bệnh tích với lượng từ 10 g đến 200 g và đựng vào lọ miệng rộng hoặc túi nilon. Bệnh phẩm phải được lấy vô trùng, bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 oC đến 8 oC và gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và các thông tin về dịch tễ.

5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1 Nuôi cấy, phân lập

Nghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch, sau đó được khử tạp khuẩn bằng dung dịch axit oxalic 5 % hay dung dịch NaOH từ 2 % tới 4 %. Huyễn dịch được lắc trong 10 min ở nhiệt độ phòng (24 oC) rồi đem trung hoà với dung dịch HCl 2 N, sau đó ly tâm. Chất cặn được sử dụng cho nuôi cấy và kiểm tra kính hiển vi.

Chất cặn được cấy lên các môi trường trứng và ủ ở 37 oC trong vòng 8 tuần, tất cả các môi trường nên được bịt kín để tránh bị khô.

Một số môi trường được dùng để nuôi cấy vi khuẩn lao như: Lowenstein Jensen (LJ), Stonebrink, Coletsos base, Herrold egg yolk (HEY). Ngoài ra, có thể sử dụng môi trường Middlebrook 7H10 hay 7H11.

5.2.2 Giám định vi khuẩn

5.2.2.1 Giám định hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy

Giám định hình thái bằng phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen theo quy định trong Phụ lục A. Vi khuẩn M. bovis hình gậy mảnh, bắt màu hồng trên nền xanh.

5.2.2.2 Giám định tính chất mọc trên các môi trường

Vi khuẩn M. bovis sẽ mọc trong vòng 3 tuần tới 6 tuần nuôi cấy.

Khuẩn lạc mọc chậm ở 37oC, nhưng không mọc ở 22oC hay 45oC.

Kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế bởi glyxerol: Cấy vi khuẩn lên cả 2 môi trường có và không có glyxerol. Trên môi trường có glyxerol vi khuẩn mọc yếu. Có thể sử dụng môi trường trứng (Lowenstein Jensen).

Kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường có 0,4 % natri pyruvat: Cấy vi khuẩn lên môi trường Lowenstein Jensen (không có glyxerol) có và không bổ sung 0,4 % natri pyruvat. Vi khuẩn M. bovis mọc tạo thành khuẩn lạc có dạng trơn, màu trắng nhạt.

Kiểm tra sự mẫn cảm của vi khuẩn với thiophen-2-carbonic axit hydrazide (TCH): Cấy vi khuẩn lên môi trường Lowenstein Jensen có bổ sung TCH 10 µg/ml: Vi khuẩn M .bovis không mọc.

5.2.2.3. Giám định các đặc tính sinh hóa

Các đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn M. bovis được trình bày ở bảng sau:

Phương pháp tiến hành: theo Phụ lục B.

6. Kết luận

Bò bị bệnh lao khi có các đặc điểm sau:

- Con vật có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích của bệnh.

- Kết quả nuôi cấy, phân lập, giám định vi khuẩn xác định là vi khuẩn Mycobacterium bovis.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM ZIEHL-NEELSEN (ZN)

A.1. Thuốc nhuộm

A.1.1. Carbon fuchsin đặc

- Chuẩn bị thuốc nhuộm

Fuchsin basic                                                                                  1,0 g

Etanol 95 % (phần thể tích)                                                             10,0 ml

Phenol                                                                                             5,0 g

Nước                                                                                               100,0 ml

- Fuchsin basic được hoà tan trong etanol, phenol được hoà tan trong nước. Trộn 2 dung dịch này với nhau và để vài ngày rồi lọc qua giấy lọc, cho vào 1 chai sạch.

A.1.2. Dung dịch axit - alcohol

Axit clohydric đặc                                                                            8,0 ml

Etanol 95 % (phần thể tích)                                                             97,0 ml

Nên cho axit HCl vào cồn etanol.

A.1.3. Dung dịch xanh metylen

Xanh metylen                                                                                  8,0 g

Etanol 95 % (phần thể tích)                                                             300,0 ml

Nước                                                                                               1300,0 ml

Kali hydroxit                                                                                     0,13 g

A.2. Cách tiến hành

Cho carbon fushin ngập tiêu bản đã được cố định và được đặt trên giá. Dùng ngọn lửa đèn cồn đốt phía dưới tiêu bản để thuốc nhuộm bốc hơi trong 10 min nhưng không được sôi.

Nhỏ dung dịch axit-alcohol trong 15 min (tẩy nhiều lần).

Nhỏ xanh metylen lên tiêu bản trong 20 s.

Rửa tiêu bản bằng nước, để khô.

A.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐẶC TÍNH SINH HÓA

B.1. Phân giải nitrat

Cho vài giọt nước vô trùng vào 1 ống nghiệm có nắp vặn (16 mm x 125 mm) và cấy vào 1 vòng que cấy vi khuẩn lao. Dùng một ống nghiệm có nước cất vô trùng khác không cấy gì làm đối chứng âm. Cho 2 ml dung dịch NaNO3 (pha dung dịch NaNO3 0,01 M trong đệm phosphat 0,022 M, pH 7). Lắc rồi ủ trong nồi đun cách thuỷ ở 37oC trong 2 h.

Cho tiếp vao ống nghiệm 1 giọt axít HCl đặc pha loãng 1/2, 2 giọt dung dịch sulphanilamid 0,2%, 2 giọt dung dịch N-(1-naphthyl) etylendiamin dihydroclorua 0,1%.

Kiểm tra sự phát triển của màu hồng cho tới đỏ và so sánh với đối chứng âm: màu đỏ sậm là phản ứng dương tính.

B.2. Kiểm tra sự mẫn cảm với pyrazinamid

Dùng môi trường nước thịt Dubos có bổ sung 0,1 g pyrazinamid, 2,0 g axit pyruvic và 15 g agar (cho 1 lít môi trường). Chia vào ống nghiệm có nắp vặn 15 ml/ống. Hấp ở 121 oC trong 15 min rồi để rắn thạch ở vị trí thẳng.

Cấy vào thạch một lượng vi khuẩn M. bovis đặc và ủ 37 oC trong 4 ngày. Sử dụng một ống không cấy và một ống cấyM. avium làm đối chứng âm và dương.

Cho 1 ml dung dịch amoni sắt (II) sulfat mới chuẩn bị vào ống và để vào tủ lạnh 4 h. Phản ứng dương tính nếu có một vạch màu hồng trong thạch.

B.3. Urease

Trộn 1 phần thạch urê cơ bản với 9 phần nước cất vô trùng. Chia vào ống nghiệm có nắp (16 mm x 125 mm), mỗi ống 4 ml.

Trộn một vòng que cấy vào trong ống, ủ ở 37oC.

Màu môi trường chuyển từ vàng sang hồng hoặc đỏ là dương tính.

B.4. Sản sinh niacin

Nên sử dụng kít thương phẩm (ví dụ sản phẩm của Difco) vì chuẩn bị phản ứng này cần sử dụng dung dịch BrCN là chất độc đối với cơ thể.