Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN5282:1990

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5282:1990

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METIONIN

Animal feeding stuffs

Method for determination of metionin content

1. Nguyên tắc của phương pháp:

Phương pháp dựa trên việc oxy hoá metionin bằng hỗn hợp hyđro peoxyt và axit foócmic để chuyển về dạng bền vững metionin sunfon và tách nó trên cột sắc ký trao đổi ion sau khi thủy phân bằng axit clohyđric 6 mol/l. Cường độ màu của phức tạo thành trong phản ứng với thuốc thử ninhydrin tỷ lệ thuận với hàm lượng axit amin có trong dung dịch.

2. Lấy mẫu:

Lấy mẫu để thử theo TCVN 4325 -86 .

3. Dụng cụ và hoá chất:

3.1. Dụng cụ:

- Máy phân tích axit amin;

- Máy nghiền mẫu;

- Máy cắt mẫu thực vật;

- Rây với đường kính lỗ rây 1mm theo TCVN 2230 - 77;

- Nồi hấp;

- Tủ sấy tự ngắt có nhiệt độ 110 ± 2⁰C;

- Cân phân tích có độ chính xác đến 0,0002 g;

- Thiết bị làm bay hơi dịch thủy ngân, hay nồi chưng cách thủy;

- Bộ định lượng dung tích 10 ml;

- Máy đo pH ;

- Ampun thủy tinh có chỗ thắt, dung tích 20 ml;

- ống nghiệm thủy tinh dung tích 20 ml;

- Bình định mức dung tích 50 ; 100 ; 1000 ml;

- Phễu thủy tinh đường kính 2 - 3 cm;

- Bát sứ để làm bay hơi;

- Pipet chia độ dung tích 1 ; 2 ; 5 ; 10 ml;

- Đũa thủy tinh;

- Giấy lọc không tro có băng xanh, đường kính 6 - 8 cm;

3.2. Hoá chất :

- Bộ thuốc thử cho máy phân tích axit amin ;

- Axit amin chuẩn (- metioninsunfon) ;

- Axit clohydric đặc (d = 1,19g/ml), THKH;

- Cồn etylíc;

- Natri xitrat, TKPT hay TKHH;

- Phenol, TKPT;

- Natri hydroxyt, TKHH;

- Hydro peoxyt, TKPT;

- Axit foomic, TKPT;

- Nước cất hay nước có độ tinh khiết tương đương;

4. Chuẩn bị thử :

4.1. Chuẩn bị mẫu để thử :

Mẫu cỏ khô, thức ăn ủ, thức ăn xanh được cắt thành từng đoạn dài 1 - 3 cm. Thức ăn củ quả được cắt thành lát mỏng có độ dày 0,8 cm; Đảo đều mẫu đã cắt trên mảnh nilon và từ những chỗ khác nhau lấy một lượng mẫu để sao cho sau khi sấy có được khoảng 100g. Sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 - 65⁰C đến khối lượng không đổi (trạng thái khô không khí). Sau khi sấy, nghiền mẫu và sàng qua dây có đường kính lỗ rây là 1mm. Phần còn lại không lọt qua rây được cắt bằng kéo hoặc nghiền lại trong cối sứ và sau đó đem trộn đều với phần đã lọt qua rây.

Mẫu thức ăn hỗn hợp, hạt ngũ cốc, khô dầu, bột từ thân lá cây xanh được nghiền nhỏ không cần sấy trước và sàng qua rây.

Những mẫu đã chuẩn bị được bảo quản trong bình thủy tinh hay bình polyetylen có nút đậy kín, để ở nơi khô ráo.

4.2. Chuẩn bị hỗn hợp oxy hoá.

Rót 9ml axit foomic vào 1ml hydro peoxyt. Dung dịch được chuẩn bị trong ngày tiến hành phân tích.

4.3. Chuẩn bị dung dịch axit clohydric 6 mol/l.

Trộn đều những thể tích bằng nhau của axit clohydric đặc với nước cất (1: 1).

4.4. Chuẩn bị dung dịch đệm có pH = 2,2.

Hoà tan 19,6 natri xitrat trong 200 - 300ml nước cất, thêm vào đó 16,6ml axit clohydric đặc, 1g phenol và đưa thể tích đến 1000ml bằng nước cất. Nồng độ ion hydro được kiểm tra trên máy đo pH và khi cần thiết, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 50% hay axit clohydric đặc.

4.5. Chuẩn bị dung dịch chuẩn metionin sunfon.

Dung dịch gốc metionin sunfon được chuẩn bị bằng cách hoà tan 181 mg metionin sunfon trong 100 ml dung dịch axit clohydric 0,1mol/l (3,1 ml axit clohydric đặc hòa tan vào 1000 ml nước cất).

Dung dịch chuẩn sử dụng khi phân tích của axit amin này được tiến hành như sau: pha loãng 25 ml dung dịch gốc metionin sunfon đến thể tích 100 ml bằng dung dịch axit clohydric 0,1mol/1.1ml dung dịch này chứa 2,5 mmol metionin sunfon .

5. Tiến hành thử.

5.1. Oxy hoá những axit amin có lưu huỳnh (metionin và xistin) trong mẫu thử.

Cân 100 mg mẫu ở trạng thái khô không khí với độ chính xác đến 0,0002g cho vào bát sứ nhỏ, đổ vào đó 5 ml hỗn hợp oxy hoá vừa mới chuẩn bị xong và tiến hành làm bay hơi trên nồi chưng cách thủy, thỉnh thoảng khuấy mẫu.

5.2. Thủy phân mẫu đã oxy hoá.

5.2.1. Thủy phân trong tủ sấy.

Rót vào phần cặn khô nhận được (theo mục 5.1) 10 ml dung dịch axit clohydric 6mol/lít và chuyển toàn bộ vào ampun thủy tinh, thêm 2 - 3 giọt cồn etylic. Hàn ampun tại chỗ thắt trên ngọn lửa ga, sau đó đặt vào giá và cho vào tủ sấy đã được đốt nóng trước có nhiệt độ 110⁰C. Tiến hành thủy phân trong 16 giờ.

5.2.2. Thủy phân trong nồi hấp.

Rót vào phần cặn khô thu được (theo mục 5.1) 10 ml dung dịch axit clohydric 6mol/lít và chuyển toàn bộ vào ống nghiệm có dung tích 20ml, thêm vào đó 2 - 3 giọt cồn etylic, đậy ống nghiệm bằng nút thủy tinh hay phễu nhỏ để tránh sự bắn toé axit trong quá trình thủy phân. Đặt ống nghiệm vào nồi hấp và thực hiện thủy phân trong 3 giờ ở nhiệt độ 137⁰C và áp suất 25 . 10⁴ Pa.

5.3. Sau khi kết thúc thủy phân, ống nghiệm (hay ampun) được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, lắc đều và lọc qua phễu thủy tinh với giấy lọc không tro. Phần nước lọc được cho vào bát sứ nhỏ, tráng ống nghiệm 2-3 lần bằng một lượng không nhiều nước cất và rửa phễu lọc bằng chính lượng nước tráng này. Đặt bát sứ lên nồi chưng cách thủy có nhiệt độ 50 - 60⁰C và làm bay hơi dịch lọc đến trạng thái còn hơi ẩm, trong quá trình làm bay hơi thỉnh thoảng khấy đều mẫu.

Rót vào phần cặn khô nhận được trong bát sứ 5 - 10ml dung dịch đệm có pH bằng 2,2 và dùng đũa thủy tinh khuấy cẩn thận đến tan hoàn toàn. Sau đó lọc dung dịch một lần nữa. Dịch thủy phân được bảo quản trong tủ lạnh.

5.4. Tiến hành phân tích trên máy.

Nạp dịch thủy phân vào cột sắc ký của máy phân tích axit amin. Để xây dựng sắc ký đồ chuẩn cần nạp lên cột dung dịch chuẩn metionin sunfon với một lượng đúng bằng thể tích dịch thủy phân của mẫu thử đã nạp trên máy. Việc phân tích được thực hiện tuần tự theo quy trình trên máy phân tích axit amin.

Kết quả được sắc ký đồ với các pic có diện tích tỷ lệ thuận với nồng độ axit amin. Diện tích S của pic được tính như diện tích hình tam giác - chiều cao của pic x 1/2 chiều rộng. Và tính hàm lượng axit amin dựa vào kết quả so sánh diện tích pic của axit amin chuẩn với diện tích pic của mẫu phân tích.

6. Tính toán kết quả.

6.1. Hàm lượng axit amin- metionin  (X) biểu thị bằng gam trong 1 kg mẫu thử ở dạng khô không khí được tính theo công thức:

Trong đó:

C - Nồng độ dung dịch chuẩn metionin sunfon, tính bằng mg/ml ;

S_tp- Diện tích píc metionin sunfon của mẫu phân tích, tính bằng mm² ;

V - Thể tích cuối cùng của dịch thủy phân, tính bằng ml ;

S_tc- Diện tích píc metionin sunfon của dung dịch chuẩn, tính bằng mm^{2 ;}

m - Khối lượng mẫu thử lấy để thủy phân, tính bằng mg ;

0,823 - Hệ số chuyển metionin sunfon về mationin.

Kết quả cuối cùng là trị số trung bình của hai lần xác định song song. Sự sai khác cho phép giữa hai lần xác định song song ở xác suất tin cậy P = 0,95 không được vượt quá 10% giá trị trung bình.

6.2. Hàm lượng metionin (X₁) biểu thị bằng gam trong 1 kg mẫu thử ở dạng vật chất khô được tính theo công thức :

Trong đó :

X - Hàm lượng metionin trong mẫu thử ở dạng khô không khí, tính bằng g/kg;

W - Độ ẩm của mẫu thử, tính bằng %.