Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-12:2011

TCVN 8400-12:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 12: BỆNH BẠCH LỊ VÀ THƯƠNG HÀN Ở GÀ

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 12: Fowl typhoid and pullorum disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh thương hàn và bệnh bạch lị trên gà.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1. Bệnh bạch lị (fowl typhoid)

Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Salmonella pullorum (S. pullorum) gây ra trên gà.

2.2. Bệnh thương hàn (pullorum disease)

Bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Samonella gallinarum (S. gallinarum) gây ra trên gà.

CHÚ THÍCH: Bệnh bạch lị và thương hàn ở gà có nhiều đặc điểm giống nhau về bệnh sử, triệu chứng lâm sàng, dịch tễ, bệnh tích và các biện pháp phòng chống bệnh. Tuy nhiên, bệnh bạch lị thường xảy ra trên gà con, ở thể cấp tính, nhiễm trùng huyết và gà lớn có thể mang trùng và bệnh ở thể cận lâm sàng. Bệnh thương hàn gà thường xảy ra trên gà với đặc điểm đặc trưng: lây lan nhanh, tỉ lệ nhiễm cao và gà con có thể mắc bệnh ở thể cấp tính. Những năm gần đây, nhiều tài liệu xếp hai loại vi khuẩn này vào chung một loài Salmonella enterica nhánh enterica (subspecies enterica) typ huyết thanh gallinarum - pullorum, nhưng chúng thuộc một hay hai typ huyết thanh khác nhau vẫn còn là vấn đề tranh luận.

3. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương.

- Môi trường thông thường: thạch máu, canh thang BHI (brain heart infusion broth).

- Môi trường chọn lọc: thạch MacConKey, thạch BG (briliant green agar) hoặc thạch XLD (xyloselysine-deoxycholate agar).

- Môi trường tăng sinh: nước selenit cystein, tetrathionat, RVS (Rappaport-Vassiliadis soya).

- Máu bê, thỏ hoặc cừu.

- Canh thang peptone (peptone water).

- Thạch Kligler hoặc thạch TSI (Triple Sugar Iron).

- Thạch lysin-sắt (lysine iron agar) hoặc canh thang lysin decarboxylase.

- Thạch simon xitrat.

- Ure.

- Maltoza.

- Ornithine.

- Ducitol.

- Kháng huyết thanh chuẩn Salmonella định typ O9.

- Thuốc thử Kovac’s.

- Thạch nguyên chất (agar bacteriological).

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:  Thiết bị điện di.-

 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37oC.

- Tủ sấy.

- Buồng cấy.

- Kính hiển vi quang học.

- Tủ lạnh.

- Que cấy.

- Đĩa Petri.

- Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1 000 ml.

5. Cách tiến hành

5.1 Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh có thể lây truyền qua trứng.

- Sản lượng trứng giảm.

- Tỷ lệ ấp nở giảm: tăng tỉ lệ chết phôi và chết non.

5.1.2 Triệu chứng lâm sàng

5.1.2.1 Ở gà con

- Tỉ lệ chết cao và chất lượng kém ở gà con mới nở.

- Bỏ ăn, ỉa chảy phân trắng dính bết vào lỗ huyệt, suy kiệt, khó thở, gà còi cọc.

- Tỉ lệ chết cao nhất ở khoảng 2 tuần tuổi đến 3 tuần tuổi.

- Có thể sưng khớp và mù mắt.

5.1.2.2 Ở gà lớn

- Thể cấp tính: vật ủ rũ, bỏ ăn, lông xù, ỉa cháy, mất nước, sốt cao. Gia cầm chết sau từ 4 ngày đến 10 ngày xuất hiện triệu chứng.

- Tỉ lệ đẻ và tỉ lệ ấp nở giảm.

- Thể mạn tính: gà có thể mang trùng, không biểu hiện triệu chứng rõ ràng.

5.1.3 Bệnh tích đại thể

5.1.3.1 Ở gà con

- Lòng đỏ lâu tiêu.

- Hoại tử từng đốm nhỏ ở phổi, cơ tim.

- Xoang bao tim tích dịch nhầy vàng.

- Viêm khớp.

- Gan, lách sưng.

- Ruột viêm cata.

- Thành manh tràng dày, có bã đậu.

5.1.3.2 Ở gà lớn

- Trứng non méo mó, dị hình, chất chứa bên trong màu vàng nâu hay xanh đen có khi có bã đậu.  Trứng rơi vào xoang bụng.

- Viêm xoang bụng, có thể viêm dính với các cơ quan trong xoang bụng.  Viêm bao tim.

5.1.4 Lấy mẫu

Bệnh phẩm là phủ tạng (gan, lách, phổi), phủ tạng của phôi, tử cung, manh tràng, ruột lấy từ 10 g đến 100 g.

Dịch ổ nhớp, phân trực tràng: dùng tăm pon vô trùng ngoáy ổ nhớp hay trực tràng. Lấy phân 10 g đến 50 g phân mới bài thải.

Lấy trứng, trứng có phôi (túi lòng đỏ), túi lòng đỏ trứng chưa tiêu (ở gà con), trứng non.

Bệnh phẩm phải được lấy vô trùng. Mỗi loại bệnh phẩm cho vào từng lọ hoặc túi ni lon vô trùng riêng biệt. Bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2oC đến 8oC và gửi về phòng thí nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu.

Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ.

5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

5.2.1 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

Môi trường nuôi cấy, phân lập bao gồm:

- Môi trường thông thường như: thạch máu, thạch thường, canh thang BHI.

- Môi trường chọn lọc như: thạch BG, thạch MacConkey hoặc thạch XLD.

- Môi trường tăng sinh như: nước selenit cystein, tetrathionat, RVS.

Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn S. pullorum và S. gallinarum tuỳ thuộc vào loại bệnh phẩm mà áp dụng phương pháp khác nhau:

- Bệnh phẩm là phân, ruột, chất chứa của ruột, manh tràng.

Nghiền bệnh phẩm trong nước muối sinh lý vô trùng (phân và chất chứa ruột hoà trực tiếp vào nước muối sinh lý) hoặc nghiền bệnh phẩm trực tiếp bằng stomacher theo tỉ lệ 1/10.

Lấy một vòng que cấy huyễn dịch bệnh phẩm, cấy vào môi trường chọn lọc, nuôi cấy ở 37 oC trong vòng 24 h đến 48 h.

Cấy huyễn dịch bệnh phẩm vào môi trường tăng sinh theo tỉ lệ 1/10, nuôi cấy ở 37 oC (selenit cystein) sau 24 h đến 48 h cấy chuyển vào môi trường chọn lọc.

- Bệnh phẩm là phủ tạng: Nghiền bệnh phẩm trong nước muối sinh lý vô trùng theo tỉ lệ 1/10. Lấy một vòng que cấy huyễn dịch bệnh phẩm vào môi trường thông thường và môi trường chọn lọc. Nuôi cấy ở 37oC từ 24 h đến 48 h cấy chuyển sang môi trường chọn lọc.

- Bệnh phẩm dịch ổ nhớp và phân trực tràng: Ria cấy (tăm pon ngoáy dịch ổ nhớp và phân trực tràng) lên môi trường chọn lọc, sau đó chuyển tăm pon vào môi trường tăng sinh (selenit cystein), nuôi cấy ở 37oC sau 24 h đến 48 h cấy chuyển sang môi trường chọn lọc.

- Cấy bệnh phẩm là lòng đỏ (của trứng và trứng non, túi lòng đỏ của trứng có phôi và gà con):

Có thể dùng pipet hay syringe vô trùng hút 100 µl lòng đỏ cấy vào 100 ml nước pepton hay canh thang BHI, trộn đều, ủ ở 37oC sau 24 h đến 48 h, cấy chuyển vào môi trường thạch máu, môi trường chọn lọc và môi trường tăng sinh. Ủ ở 37oC sau 24 h đến 48 h, cấy chuyển vào môi trường chọn lọc.

Có thể lấy tăm pon, nhúng vào lòng đỏ, dùng tăm pon ria cấy lên môi trường thạch máu, môi trường chọn lọc, sau đó chuyển tăm pon vào môi trường canh thang BHI. Ủ ở 37oC sau 24 h đến 48 h, cấy chuyển vào môi trường chọn lọc.

- Bệnh phẩm là phôi: Nghiền phủ tạng của phôi, lấy một vòng que cấy, ria cấy lên môi trường thạch máu, môi trường chọn lọc và cấy vào môi trường tăng sinh. Sau 24 h đến 48 h nuôi cấy ở 37oC (môi trường selenit cystein), cấy chuyển vi khuẩn vào môi trường chọn lọc.

- Bệnh phẩm là vỏ trứng: Nghiền nhỏ vỏ trứng vào cấy môi trường trường tăng sinh (selenit cystein) ở nhiệt độ 37 oC, sau 24 h đến 48 h cấy chuyển vi khuẩn vào môi trường chọn lọc.

Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường phân lập sau 24 h đến 48 h nuôi cấy như sau:

- Trên môi trường thạch máu hoặc thạch thường khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella có hình tròn, trơn, mặt vồng và màu trắng hơi đục, đường kính khoảng 1 mm đến 2 mm.

- Trên môi trường thạch MacConkey khuẩn lạc có hình tròn, trơn, hình vòm, màu trắng hơi đục.

- Trên môi trường thạch BG: Khuẩn lạc có hình tròn, trơn, màu hồng đậm

- Trên môi trường thạch XLD: Khuẩn lạc có hình tròn, trơn, màu đỏ có nhân đen.

Chọn khuẩn lạc có hình thái đặc trưng cấy vào môi trường thạch thường hoặc thạch máu hay canh thang BHI, nuôi cấy ở 37oC trong vòng 18 h đến 24 h để tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hoá và huyết thanh học.

5.2.2 Giám định vi khuẩn

5.2.2.1 Giám định sinh hóa

Để kiểm tra đặc tính sinh hóa có thể sử dụng các kit sinh hóa thương mại và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc sử dụng các loại môi trường như: thạch TSI, thạch lysin-sắt (hoặc canh thang lysin decarboxylase), ure, orthinine decarbocylation; môi trường thử lên men đường maltoza, dulcitol; môi trường kiểm tra di động (xem Phụ lục A).

Bảng 1 - Một số đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn S. pullorum và S. gallinarum

5.2.2.2 Giám định huyết thanh

Xác định kháng nguyên O: Định typ kháng nguyên O (nhóm O9 hay nhóm D) bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh chuẩn O9 hay kháng huyết thanh nhóm D. Các bước tiến hành phản ứng và đọc kết quả theo chỉ dẫn của nhà sản xuất kháng huyết thanh. Tính kháng nguyên của S. pullorum và S. gallinarum được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Tính kháng nguyên của S. pullorum và S. gallinarum

5.2.3. Chẩn đoán huyết thanh học

Phản ứng huyết thanh ứng dụng để chẩn đoán sự nhiễm bệnh trên toàn đàn. Để xác định sự nhiễm bệnh trên tổng đàn phải lấy một lượng mẫu đủ lớn theo ước lượng tỉ lệ lưu hành và độ tin cậy. Sử dụng phần mềm chuyên dụng (ví dụ Win Episcope 2.0) để xác định lượng mẫu cần lấy (xem Phụ lục B).

Các phản ứng hay dùng để phát hiện kháng thể là phản ứng ngưng kết nhanh giữa kháng nguyên với máu (toàn máu) hay huyết thanh trên phiến kính, ngưng kết trong ống nghiệm, hoặc ngưng kết trên đĩa 96 giếng.

Phản ứng thường sử dụng kháng nguyên thương phẩm và tiến hành phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6. Kết luận

Gà được xác định là mắc bệnh thương hàn hay bạch lị khi:

- Có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh;

- Phân lập được vi khuẩn S. pullorum hay S. gallinarum trong phòng thí nghiệm.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA

A.1 Phản ứng sinh Indol

A.1.1 Thuốc thử Kovac’s 

Thành phần

Paradimetylaminobenzaldehyt                            5 g

Cồn amyla                                                        75 ml

HCl đặc                                                            25 ml

Chuẩn bị

Hoà dung dịch paradimetylaminobenzaldehyde vào cồn amyla cho tan hết và để trong tủ lạnh 4 oC. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml HCl hoà đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục bổ sung HCl.

Bảo quản thuốc thử trong lọ màu, ở 4 oC.

A.1.2 Cách tiến hành

Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone hoặc môi trường nước peptone có bổ sung tryptophan, nuôi cấy ở 37oC. Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ.

A.1.3 Kết quả

Phản ứng dương tính khi có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường (sinh Indol).

Phản ứng âm tính khi không có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường.

A.2 Môi trường kiểm tra khả năng phân huỷ ornithine

Môi trường:

Canh thang peptone (v)

Ornithine (khối lượng/thể tích)                            0,5 %

Glucose (khối lượng/thể tích)                             0,1 %

Chỉ thị màu đỏ tía bromocresol (phần thể tích)    0,1 %

Chỉnh pH = 6,0

Chuẩn bị chỉ thị màu đỏ tía bromocresol:

Đỏ tía bromocresol                                            1,5 g

Cồn 90 %                                                          100 ml

Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào trong môi trường có chứa Ornithine và chỉ thị màu, nuôi cấy ở 37 oC từ 18 h đến 24 h. Nếu vi khuẩn phân huỷ Ornithine thì môi trường chuyển sang kiềm và làm đổi màu môi trường.

A.3 Đặc tính lên men đường glucose, lactose, sinh H₂S

Chuẩn bị môi trường TSI hay Kligler (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)

Lấy khuẩn vi khuẩn ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng vào môi trường TSI hay Kligler nuôi ở 37 oC, sau 24 h kiểm tra.

Lên men đường lactoza:

- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng.

- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng. 
Lên men đường glucose:

- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng.

- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng. Khả năng sinh H₂S:

- Dương tính: Ống nghiệm có màu đen.

- Âm tính: Ống nghiệm không có màu đen. 

Khả năng sinh hơi:

- Dương tính: Thạch trong ống nghiệm bị nứt hay đẩy lên.

- Âm tính: Thạch trong ống nghiệm không bị nứt hay đẩy lên.

A.4 Đặc tính phân huỷ lysin

Sử dụng môi trường có lysin như canh thang lysin decarboxylase hoặc thạch lysin-sắt.

Pha chế thạch nghiêng chế từ thạch lysin-sắt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thạch màu tím nhạt và có 2 phần: phần thạch đứng (chân) và phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactoza.

Lấy khuẩn vi khuẩn ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy ở 37 oC trong điều kiện hiếu khí, sau 24 h kiểm tra lại.

- Phản ứng dương tính: Đáy ống nghiệm (phần thạch đứng) có màu tím đậm. - Phản ứng âm tính: Đáy ống nghiệm chuyển màu vàng.

A.5 Tính di động

Kiểm tra đặc tính di động của vi khuẩn trong môi trường thạch lỏng.

Thành phần môi trường

Canh thang peotone  100 ml

Thạch nguyên chất 0,25 g

Chuẩn bị

Hòa tan thạch vào nước peptone, chia ra ống nghiệm mỗi 3 ml hấp vô trùng 121 oC trong 15 min.

Cấy chích sâu vi khuẩn nghi ngờ thuần khiết vào môi trường (cấy vào giữa ống nghiệm, theo chiều thẳng đứng đến đáy ống nghiệm), ủ 37 oC sau 18 h đến 24 h kiểm tra kết quả.

- Phản ứng dương tính: Thạch trong ống nghiệm trở nên đục do vi khuẩn mọc lan ra toàn bộ phần thạch trong ống nghiệm.

- Phản ứng âm tính: Dọc theo đường cấy môi trường đục (do vi khuẩn chỉ mọc xung quanh đường

cấy), môi trường xung quanh trong suốt.

A.6 Lên men đường maltoza và dulcitol

A.6.1 Chuẩn bị môi trường

Pha nước peptone theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. 

Chuẩn bị chỉ thị màu

Thành phần

Fuchsin axit                                                      0, 5 g

Nước                                                                100 ml

Dung dịch NaOH 1 N

Chuẩn bị

Nghiền fuchsin, hoà vào nước cho tan hết. Cho từ từ lượng NaOH 1 N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 ml đến 17 ml). Để lắng từ 1 h đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp 120 oC trong 15 min.

Cho 1 ml chỉ thị màu Andrade vào 100 ml môi trường nước peptone, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp 120 oC trong 30 min.

Chuẩn bị dung dịch đường: dung dịch đường 10 % (pha trong nước) hấp 110 oC trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần 100 oC trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Cho đường vào các ống môi trường: mỗi ống (4 ml) một loại đường riêng rẽ theo tỷ lệ 0,3 ml dung dịch đường 10 %.

A.6.2 Phương pháp kiểm tra và đọc kết quả

Cấy vi khuẩn đã nuôi cấy thuần khiết vào các ống môi trường peptone có đường, để tủ ấm 37 oC, sau 24 h đọc kết quả.

Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu. Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu đỏ.

A.7 Phân giải urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (Urea agar base - Christensen) chế môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Cấy vi khuẩn vào môi trường có ure, nuôi cấy ở 37 oC sau 24 h đọc kết quả. - Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu tím.

- Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

PHƯƠNG PHÁP TÍNH SỐ MẪU MÁU CẦN LẤY ĐỂ KIỂM TRA KHÁNG THỂ S. PULLORUM VÀ S. GALLINARUM BẰNG PHẦN MỀM WIN EPISCOPE 2.0

Các thông tin cần biết để tính số lượng mẫu (input of DATA) gồm:

- Tổng đàn (Population size)

- Tỉ lệ lưu hành ước đoán (Expected prevalence %)

- Sai số cho phép (Accepted error %)

- Độ tin cậy (Level of confidence %)

- Tính số mẫu cần lấy (Calculate)

Điền toàn bộ thông tin vào phần “input of DATA” của bảng.

VÍ DỤ: Ở bảng trên:

Tổng đàn (Population size) là: 1000 con

Tỉ lệ lưu hành ước đoán (Expected prevalence %) là: 10 % 

Sai số cho phép (Accepted error %): 5 %

Độ tin cậy (Level of confidence): 95 %

Số mẫu cần lấy (Use value of n (a)) là 122.